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IHC 實驗操作步驟

免疫組化方法(石蠟切片)

轉自CST中國 CST博士互助平臺

*重要提示:參考抗體說明書選用合適的抗體稀釋液和抗原修復處理方法。IHC方法:抗原修復緩沖液/抗體稀釋液

A.     所需溶液和試劑

1. 二甲苯

2. 無水乙醇(100% 95%,變性無水乙醇,組織學級)

3. 去離子水(dH2O

4. 蘇木精(可選)

5. 漂洗(緩沖)液:

1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)配制時,取100 ml 10X TBS900 ml水稀釋至1升。加入1 ml Tween-20,混勻。

10X Tris緩沖鹽水(10X TBS)800 ml蒸餾水中加入24.2 g 三羥甲基氨基甲烷(Trizma base, C4H11NO3)和80 g 氯化鈉(NaCl)。用濃鹽酸將pH調節到7.6,定容至1 L

6. *抗體稀釋液

a. SignalStain? 抗體稀釋液 #8112

b. TBST / 5%正常山羊血清: 5 ml 1 X TBST 中添加250 μl正常山羊血清。

c. PBST / 5%正常山羊血清: 5 ml 1 X PBST 中添加250 μl正常山羊血清。

1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制時,取100 ml 10X PBS900 ml水稀釋至1 L。加入1 ml Tween-20,混勻。

10X 磷酸鹽緩沖液 (10X PBS): 800 ml水中加入80 g 氯化鈉(NaCl, 2 g 氯化鉀(KCl, 14.4 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和2.4 g 磷酸二氫鉀(KH2PO4)。調整pH7.4,定容至1 L

7. *抗原修復:

a. 檸檬酸鹽:10 mM檸檬酸鹽緩沖液:稱取2.94g二水合檸檬酸鈉(C6H5Na3O7?2H2O)溶解在800 ml水中。調整pH6.0,定容至1 L

b. EDTA: 1mM EDTA: 稱取0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2?2H2O) 溶解在800 ml水中。調整pH8.0,定容至1 L

c. TE10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制時,稱取1.21 g Trizma?堿(C4H11NO3)和0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2?2H2O) 溶解在950 ml蒸餾水中。調整pH9.0,然后用蒸餾水定容至到1 L

d. 胃蛋白酶:1 mg/ml,溶解在pH2.0Tris鹽酸緩沖液中。

8. 3%過氧化氫:配制時,將10 ml 30% H2O2加入到90 ml蒸餾水中。

9. 封閉液:TBST/5%正常山羊血清:5 ml 1X TBST中添加250 μl正常山羊血清。

10. 檢測系統:根據廠家說明書使用。已有的檢測系統:

SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125

注意如果本產品沒有使用本試劑優化過,可能需要通過滴定法來確定最佳條件。

11. DAB試劑或合適的底物:按產品說明配制。

 

B.      脫蠟處理/再水化

注意:操作中任何時候都不要晾干玻片

1. 脫蠟處理/切片的水化:

a.       用二甲苯浸洗切片3次,每次5分鐘。

b.       用無水乙醇浸洗切片2次,每次10分鐘。

c.       95%乙醇浸洗切片2次,每次10分鐘

2. 在蒸餾水中漂洗2次,每次5分鐘。

 

C.     *抗原修復

注意:參考抗體說明書選用合適的抗原修復緩沖液,按以下步驟操作。

1. 檸檬酸緩沖液處理:加熱浸泡在10 mM pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中的玻片,使之維持在準沸騰的溫度(95-99°C10分鐘。取出放在實驗臺上自然冷卻30分鐘。

2. EDTA處理:加熱浸泡在1 mM pH 8.0 EDTA溶液中的玻片,使之維持在準沸騰的溫度(95-99°C15分鐘。不需另加冷卻步驟。

3. TE處理:加熱浸泡在pH 9.010 mM TE/1 mM EDTA溶液中的玻片,使之維持在準沸騰的溫度(95-99°C18分鐘。取出放在實驗臺上自然冷卻30分鐘。

4. 胃蛋白酶處理:37°C消化10分鐘。

 

D.     染色

注意:查詢產品說明書推薦的抗體稀釋比例。

1. 切片用漂洗液洗兩次,每次5分鐘。

2. 浸泡在3% H202中孵育10分鐘

3. 用蒸餾水漂洗兩次,每次5分鐘。

4. 用漂洗液洗5分鐘

5. 在切片上滴加100-400 μl封閉液,室溫封閉1小時。

6. 去掉封閉液,每個切片上加100-400 μl稀釋的一抗。4°C孵育過夜。

7. 去掉抗體稀釋液。用漂洗液洗3次,每次5分鐘。

8. 根據廠家說明書,用合適的檢測系統檢測。

9. 用漂洗液洗3次,每次5分鐘。

10. 加入100–400 μl DAB或合適的底物,近距離檢測染色進展。

11. 一旦切片染色成功,立刻將玻片浸入水中。

12. 如有需要,將切片泡在蘇木精溶液中復染,按照產品說明進行。

13. 切片用蒸餾水洗兩次,每次5分鐘。

14. 切片脫水:

a. 95%乙醇中孵育兩次,每次10秒。

b. 100%乙醇中孵育兩次,每次10秒。

c. 在二甲苯中孵育兩次,每次10秒。

15. 加上蓋玻片。



免疫組化方法(冰凍切片)

A.     所需溶液和試劑

1. 二甲苯

2. 無水乙醇(100% 95%,變性無水乙醇,組織學級)

3. 蘇木精(可選)

4. 固定劑:請參考產品說明書選取合適的固定劑。

a. 10%中性福爾馬林

b. 丙酮

c. 甲醇

d. 3%甲醛溶液:配制時,將18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。

5. 10X Tris緩沖鹽水(10X TBS):800 ml蒸餾水中加入24.2 g 三羥甲基氨基甲烷(Trizma base C4H11NO3)和80 g 氯化鈉(NaCl)。用濃鹽酸將pH調節到7.6

6. 漂洗(緩沖)液:1 X Tris緩沖鹽水(TBS)。100 ml 10 X TBS900 ml水至1L

7. 甲醇/過氧化氫:配制時,將10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C

8. 封閉液:1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。配制時,將500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

9. 檢測系統:根據廠家說明書使用。已有的檢測系統*

10. DAB試劑或合適的底物:按產品說明配制。

 

B.      切片

1. 對于保存在-80°C的樣品:切片前先從冰箱中取出放在-20°C平衡15分鐘左右。這可以避免切片時樣品斷裂。

2. 將樣品切成大約6-8 μm厚,鋪在帶正電性的玻片上。

3. 固定前,可以把切片攤開放在實驗臺上風干幾分鐘。(這有助于切片貼緊玻片)

 

C.     固定

注意:參考產品說明書(抗體)選擇合適的固定劑

1. 玻片上的切片風干后,選用如下合適的固定劑進行固定。

a. 10%中性福爾馬林:室溫10分鐘。立即進行染色操作。

b. 冰丙酮:-20°C 10分鐘。風干。立即進行染色操作。

c. 甲醇-20°C 10分鐘。立即進行染色操作。

d. 3%甲醛溶液:室溫15分鐘。立即進行染色操作。

e. 3% 甲醛/甲醇:先在室溫下3%甲醛中固定15分鐘,然后在-20°C的甲醇中固定5分鐘(中間不漂洗)。立即進行染色操作。

 

D.     染色

1. 切片用漂洗液洗兩次,每次5分鐘。

2. 室溫下,浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分鐘

3. 用漂洗液洗兩次,每次5分鐘。

4. 在切片上滴加封閉液,室溫封閉1小時。

5. 按抗體說明書的推薦比例將抗體稀釋在封閉液中。

6. 去掉切片上的封閉液,每個切片上加100-400 μl稀釋的一抗。4°C孵育過夜。

7. 去掉抗體。用漂洗液洗3次,每次5分鐘。

8. 根據廠家說明書,用合適的檢測系統*檢測。

9. 用漂洗液洗3次,每次5分鐘。

10. 加入100–400 μl DAB或合適的底物,近距離檢測染色進展。

11. 一旦切片染色成功,立刻將玻片浸入水中。

12. 如有需要,將切片泡在蘇木精溶液中復染,按照產品說明進行。

13. 切片用蒸餾水洗兩次,每次5分鐘。

14. 切片脫水:

a. 95%乙醇中孵育兩次,每次10秒。

b. 100%乙醇中孵育兩次,每次10秒。

c. 在二甲苯中孵育兩次,每次10秒。

15. 加上蓋玻片。



*已有的檢測系統:

SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125


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